کشت پروتوپلاست

کشت پروتوپلاست

اولین مطالعات جدی در زمینه پروتوپلاست به اوایل دهه ۱۹۶۰ میلادی بازمی‌گردد، زمانی که پژوهشگران موفق شدند با استفاده از آنزیم‌های لیزکننده مانند سلولاز و پکتیناز، دیواره سلولی گیاهان را حذف کرده و سلول‌ های بدون دیواره (پروتوپلاست) را به دست آورند. تاکیوکوک و کوهلیستر از پیشگامان این تحقیقات بودند و روش‌ هایی برای جداسازی و کشت پروتوپلاست ارائه دادند.

در دهه‌ های بعد، تکنیک‌ های کشت پروتوپلاست بهبود یافت و محققان دریافتند که این روش به‌ ویژه در گیاهانی که به‌ سختی از طریق کشت بافت معمولی قابل باززایی هستند، بسیار مفید است. همچنین امکان مطالعه سلول‌ های گیاهی در غیاب دیواره سلولی، فرصت‌ های جدیدی را برای دست‌ ورزی ژنتیکی فراهم کرد.

پروتوپلاست چیست؟

سلول های گیاهی علاوه بر غشای پلاسمایی دارای یک دیواره سلولزی نیز هستند که سلول را از ورود عوامل خارجی و بیماری زا حفظ کرده ، شکل داده و از آسیب های فیزیکی در امان می دارد.

در کشت بافت سلولی برای کشت تک سلول، دیواره سلولی از جذب و تبادل مواد و عناصر غذایی با محیط کشت جلوگیری می کند، بنابراین لازم است تا این دیواره سلولزی حذف شود، بنابراین به سلول گیاهی یا باکتریایی که دیواره آن حذف شده باشد، پروتوپلاست گفته می شود. باید به این نکته توجه کرد که پروتوپلاست های باکتریایی گاهی اسفروپلاست نیز نامیده می شوند.

محتوای پروتوپلاست

محتوای پروتوپلاست شامل تمام اجزای یک سلول از غشا تا هسته و اندامک های داخلی می باشد که قابلیت تقسیم سلولی، رشد و تبدیل به یک موجود کامل را دارد.

پژوهشگران همواره به دنبال ریزنمونه های جدید و مناسب تر برای کشت بافت بودند در همین راستا کشت تک سلول با حذف دیواره سلولی (پروتوپلاست) ابداع شد.

منابع پروتوپلاست

سلول های مزوفیل برگ (سلول های پارانشیم کلروفیل دار) بهترین منبع تهیه پروتوپلاست است اما منابع دیگری مانند ریشه، برگ، گلبرگ، میوه، غده و سلول های میکروسپور تک هسته ای (تترادی) نیز برای تهیه پروتوپلاسم مورد استفاده قرار می گیرد که توانایی باززایی پروتوپلاست به بافت مورد استفاده، سن گیاه، رطوبت نسبی، نور، درجه حرارت و … بستگی دارد.

کالوس و کشت های سوسپانسیون سلولی نیز بعنوان منابع تهیه غیر مستقیم پروتوپلاست قابل استفاده هستند از آنجایی که پروتوپلاست های استخراج شده از این منابع به نسبت منابع مستقیم که در بالا ذکر شد، دارای توانایی تقسیم سلولی و رشد بهتری هستند لذا ریزنمونه های قابل اعتمادتری برای کشت بافت سلولی هستند. برای تهیه پروتوپلاست بهتر است از سلول هایی که در مراحل ابتدایی فاز لگاریتمی رشد هستند، استفاده شود.

آنزیم های لیزکننده مانند همی سلولاز (Hemicellulase) و سلولیزین (Cellulyzin) دیواره سلولی، یاخته گیاهی را هضم می کنند سپس پروتوپلاست باقی مانده بوسیله روش های EPG یا الکتروپوریشن (Electroporation) مختلط شده و مراحل تقسیم سلولی، تمایز و باززایی را در محیط کشت طی می کنند.

تفاوت‌های کشت پروتوپلاست با سایر انواع کشت بافت گیاهی

حذف دیواره سلولی

در کشت پروتوپلاست، برخلاف سایر روش‌های کشت بافت، دیواره سلولی کاملاً حذف می‌شود. این ویژگی امکان دسترسی مستقیم به محتوای سلول و انتقال مواد ژنتیکی را فراهم می‌کند.

نیاز به شرایط خاص برای باززایی

پروتوپلاست‌ ها بسیار حساس هستند و برای باززایی و تقسیم سلولی به شرایط محیطی دقیق و ترکیبات خاص در محیط کشت نیاز دارند.

قابلیت همجوشی و انتقال ژن

حذف دیواره سلولی باعث می‌شود پروتوپلاست‌ها قابلیت همجوشی با سلول‌ های دیگر را داشته باشند و برای وارد کردن DNA خارجی از تکنیک‌هایی مانند الکتروپوریشن استفاده شود.

مراحل کشت پروتوپلاست در کشت بافت گیاهی

تهیه پروتوپلاست

جداسازی سلول‌ ها و هضم دیواره سلولی با آنزیم‌های لیزکننده.

خالص‌سازی و انتقال به محیط کشت

پروتوپلاست‌ها در محیط کشت مایع یا ژل‌مانند منتقل شده و شرایط بهینه برای رشد فراهم می‌شود.

تقسیم و باززایی

در صورت موفقیت‌ آمیز بودن کشت، پروتوپلاست‌ ها شروع به تقسیم می‌کنند و می‌توانند به کالوس یا گیاه کامل باززایی شوند.

اهمیت کشت پروتوپلاست در تحقیقات زیستی و زیست‌ فناوری

کشت پروتوپلاست به دلیل قابلیت‌ های منحصر به‌ فرد خود، در پیشرفت‌های متعددی در حوزه‌های زیست‌ فناوری، ژنتیک گیاهی و علوم سلولی نقش کلیدی ایفا کرده است. برخی از این دستاوردها عبارتند از:

امکان همجوشی سلولی و تولید هیبریدهای بین‌ گونه‌ای

با استفاده از پروتوپلاست‌ها، دانشمندان توانستند سلول‌ های گیاهی از گونه‌های مختلف را با یکدیگر ادغام کرده و گیاهان هیبریدی جدیدی تولید کنند. این تکنیک برای بهبود صفات زراعی مانند مقاومت به آفات و شرایط محیطی مورد استفاده قرار گرفته است.

تولید گیاهان تراریخته

پروتوپلاست‌ها ابزار مناسبی برای انتقال ژن‌ های خارجی به سلول‌ های گیاهی هستند. از طریق روش‌ هایی مانند الکتروپوریشن و روش PEG، می‌توان ژن‌ های مورد نظر را به سلول‌ های گیاهی وارد کرد و سپس با باززایی این سلول‌ ها، گیاهانی با صفات ژنتیکی اصلاح‌شده تولید کرد. 

مطالعه مکانیسم‌های سلولی و مولکولی

حذف دیواره سلولی امکان دسترسی مستقیم به اجزای داخلی سلول را فراهم می‌کند. این ویژگی به محققان اجازه می‌دهد تا فرآیندهایی مانند تبادلات یونی، تقسیم سلولی، تمایز و بیان ژن‌ها را به دقت بررسی کنند.

بهبود گیاهان زراعی

با استفاده از کشت پروتوپلاست، دانشمندان توانسته‌اند گیاهانی با صفات بهبود‌یافته مانند افزایش عملکرد، مقاومت به خشکی و بیماری‌ها را توسعه دهند. این دستاوردها به‌ویژه در کشاورزی پایدار و تولید محصولات با کیفیت بالا اهمیت دارد.

کاربردهای صنعتی و دارویی

پروتوپلاست‌ها در تولید ترکیبات ارزشمند مانند متابولیت‌های ثانویه، آنزیم‌ها و پروتئین‌ های دارویی نقش دارند. این تکنیک به شرکت‌های زیست‌ فناوری کمک کرده است تا از گیاهان به‌عنوان کارخانه‌ های زیستی استفاده کنند.